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黃志清老師 研究室簡介

 

主要研究領域分析化學、環境化學、奈米技術

相關研究領域環境分析、綠色能源、奈米感測器、奈米藥物

使用生物材料細胞、斑馬魚、海藻、細菌、酵母菌

研究計畫簡介

1.     偵測重金屬離子奈米感測器: 製備功能性奈米材料於汞離子和鉛離子等重金屬離子偵測。

2.     偵測蛋白質與DNA之奈米感測器: 修飾抗體或適合體奈米粒子於血液或細胞等生物樣品中偵測腫瘤標記物和核酸等。

3.     發光微奈米粒子合成與應用: 合成並調控發光微奈米粒子的放光行為與生醫檢測應用。

4.     抗凝血奈米藥物: 利用適合體修飾的奈米粒子調控凝血酶活性,研發低副作用高效率抗凝血藥物。

5.     奈米粒子於質譜應用: 製備奈米材料於質譜中偵測蛋白質、核酸和腫瘤細胞與癌組織顯影

6.     仿生物催化奈米酵素: 合成具超高催化效率之仿生奈米材料與生物感測器與綠能材料開發‧

 

實驗室常用技術

奈米材料(金、銀、氧化鐵、氧化矽、石墨烯、碳量子點等)合成與鑑定(TEMSEMAFMXPSIRXRDICP-MS)、細胞培養、光譜儀(吸收、螢光、拉曼等)、細胞與組織顯影、質譜儀

 

未來產業連結

奈米藥物、綠能技術、環境檢測、生醫材料、半導體

實驗室專頁

https://sites.google.com/site/drhuangccnanolab/

黃志清 研究室介紹

一、重金屬與陰離子奈米感測器

利用金奈米粒子 (gold nanoparticles, Au NPs)開發之重金屬感測器分別檢測汞物種 (: 汞離子(Hg2+)、甲基汞 (CH3Hg+)、乙基汞 (C2H5Hg+)、苯基汞 (C6H5Hg+))和鉛離子 (Pb2+)。利用螢光染料羅丹明6G (Rhodamine 6G, R6G)3-巰基丙酸 (3-mercaptopropionic acid, MPA)與牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)修飾的Au NPs (BSA@R6G/MPAAu NP),因Hg2+會透過與Au NPs的金屬親和力與MPA上羧基的作用力將Au NPs表面的R6G取代,故可藉由R6G螢光強度定量樣品中汞物種的濃度,添加不同的遮蔽劑 (masking agent)可分別偵測不同的汞物種。另外,利用一維的碲奈米線 (tellurium nanowires, Te NWs) 也可簡單偵測Hg2+Te NWsHg2+因伽凡尼置換反應 (galvanic replacement reaction)導致聚集沉澱,所以可由Te NWs的顏色變化定量Hg2+,並進一步將另一形狀的碲奈米管 (tellurium nanotubes, Te NTs)結合瓊脂糖凝膠膜 (tellurium nanotubes-modified agarose gel membrane, Te NTs–AGM)形成奈米複合材料之吸附劑,有效用於去除環境樣品中Hg2+。此外,利用2-巰基乙醇 (2-mercaptoethanol, 2-ME)與硫代硫酸根離子 (thiosulfate, S2O32)Au NPs所組成之感測器(2-ME/S2O32Au NPs)可藉由Pb2+浸蝕 (leaching) Au NPs使得吸收值下降,藉此偵測樣品中的Pb2+。也利用BSA2-ME/S2O32修飾於Au NPs (2-ME/S2O32-BSAAu NPs)亦可偵測Pb2+,並藉由銅離子 (Cu2+)會吸附於Au NPs上的特性,促使Pb2+/2-ME/S2O32-BSAAu NPs leaching效果減低,並以Au NPs吸收值變化定量Cu2+。再者,分別將此兩種感測器吸附於硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, NCM),成功開發兼具便利使用、快速檢測等特性的試紙感測器 (2-ME/S2O32-BSAAu NPs/NCM),在微波照射下可在十分鐘內利用肉眼判斷pM等級的Pb2+樣品,而 Pb2+/2-ME/S2O32-BSAAu NPs/NCM可應用於高鹽類、高蛋白質與高硫醇等環境 (如血液、溪水與海水)偵測Cu2+。另外,將Au NPs吸附於氧化鋁 (Al2O3)上開發成兼具定量和移除各種汞物種的雙功能感測器 (Au NPsAl2O3),且適用於各種水樣 (如湖水、地下水與海水)中汞物種的偵測與移除等應用。

金屬離子與去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)適合體 (aptamer)結合能形成特殊摺疊的構型,可作為重金屬離子的感測器。。以33個單元的聚胸腺嘧啶寡核苷酸 (33-mer polythymine oligonucleotide, T33)可選擇性偵測Hg2+Hg2+誘導形成T-Hg2+-TT33摺疊成特殊構型使之結合更多TOTO-3染料,故隨Hg2+增加螢光亦隨之增強,偵測極限可達nM

於偵測陰離子部分,將螢光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)BSA修飾Au NPs (FITC-BSAAu NPs),由於碘離子 (I)和氰離子 (CN)透過與Au NPs的高親和力將Au NPs表面的FITC取代下來,藉由螢光強度判斷樣品中ICN的濃度,添加不同的masking agent可分別偵測ICN,可應用於高鹽度樣品 (如海水)檢測I,並可利用抗壞血酸 (ascorbic acid)將食鹽中添加的碘酸根離子 (IO3)還原成I,藉此用來偵測所添加的IO3濃度。利用聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮) (poly(N-vinyl-2-pyrrolidone))穩定的Au NPs (34.2 nm)在甘氨酸-氫氧化鈉緩衝溶液(Glycine-NaOHpH 9.0)下利用銀離子 (Ag+)CN當作浸蝕劑 (leaching agent)來檢測I。為了可直接用肉眼檢測I及於長時間下維持探針的穩定,將Au NPs修飾混合纖維素酯膜 (mixed cellulose ester membrane, MCEM)製備成Au NPs/MCEM。當I加入到系統中,強的Ag/Au離子和I離子作用力會抑制Au NPs表面的Au+leaching的速率,使試紙的顏色仍能保持紅色 (Au NPs的顏色),故藉由試紙的顏色深淺可以來偵測I

1.        Y.-W. Lin*, C.-C. Huang and H.-T. Chang*, Analyst 2011, 136, 863–871.

2.        H.-Y. Chang, T.-M. Hsiung, Y.-F. Huang* and C.-C. Huang*, Environ. Sci. Technol. 2011, 45, 1534–1539.

3.        Y.-F. Lee and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 2747–2754.

4.        T.-Y. Wei, H.-Y. Chang, Y.-F. Lee, Y.-L. Hung and C.-C. Huang*, J. Chin. Chem. Soc. 2011, 58, 732–738.

5.        Y.-F. Lee, T.-W. Deng, W.-J. Chiu, T.-Y. Wei, P. Roy and C.-C. Huang*, Analyst 2012, 137, 1800–1806.

6.        S.-I. Lo, P.-C. Chen, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Environ Sci. Technol. 2012, 46, 2724–2730.

7.        S.-C. Wei, P.-H. Hsu, Y.-F. Lee, Y.-W. Lin* and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 2652–2658.

8.        Y.-F. Lee, F.-H. Nan, M.-J. Chen, H.-Y. Wu, C.-W. Ho, Y.-Y. Chen and C.-C. Huang*, Anal. Methods 2012, 4, 1709–1717.

9.        T.-Y. Wei, H.-Y. Chang and C.-C. Huang*, RSC Adv. 2013, 3, 13983−13989.

10.    Y.-W. Shen, P.-H. Hsu, B. Unnikrishnan, Y.-J. Li, and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 2576–2582.

在我們過去研究中,已解決於高鹽類、高蛋白與高硫醇的樣品中偵測金屬離子的限制,也成功開發成試紙型重金屬離子檢測,但所使用的反應液濃度過高而未達環境保護的目標,所以開發這些感測器還有很多改善空間。另外,我們利用綠色化學的合成方法 (如用糖類還原出綠色奈米材料或是用蛋白質合成螢光金奈米材料)可以減少檢測對環境的直接傷害,是目前致力發展的目標之一。另一方面,CN/Ag+−Au NPs/MCEM複合薄膜可用肉眼辨識方式偵測I,這種可用肉眼辨識偵測物的薄膜感測器亦是目前致力發展的目標之一。

 

二、偵測蛋白質與DNA之奈米感測器

接著利用aptamer修飾的Au NPs (Apt−Au NPs) DNA嵌合染料 (DMDAP),經由螢光訊號放大(高達40)可用來偵測血小板生長因子(platelet-derived growth factors, PDGFs),對PDGF具有高專一性和高靈敏度 (~ pM),而對PDGF receptor-α偵測極限 (limit of detection, LOD) 也有nM。我們亦開發單股DNA兩端分別修飾螢光基團 (fluorophore) 和消光基團 (quencher)形成髮夾 (hairpin)結構,標記目標DNA分子作為生物感測器,於鹽類及Hg2+的環境下形成髮夾結構導致螢光關閉 (fluorescence off),而當與目標DNA互補時,Hg2+與胸線嘧啶 (thymidine, T)的結合力減弱,會使螢光上升,此方法可用來辨識生物樣品中的DNA單一核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism, SNP)。凝血酶 (thrombin, Thr)與血栓形成及血小板的活化有關,也可當成腫瘤標記物。因此,本實驗室發展出使用血纖維蛋白原 (fibrinogen, Fib)Au NPs為基礎的免標記分析法 (label-free assay),具有良好的選擇性並可偵測thrombin濃度至pM等級,製備出偵測thrombinfibrinogen的探針: (1) 利用thrombin裂解fibrinogen誘導Au NPs聚集; (2) 透過修飾thrombinAu NPs (Thr−Au NPs) 可偵測血漿中誘導Au NPs聚集的fibrinogenLOD可達nMThrombin結合適合體 (thrombin-binding aptamers, TBA) 修飾於Au NPs上後,TBA29−Au NPs具極佳抗凝血能力。有鑑於此,在TBA29尾端和Au NPs上分別修飾上鐮刀型貧血 (sickle-cell anemia, SCA)基因互補的序列,以三明治的方式偵測目標DNA序列,由呈色方式偵測SNP,目標DNA的偵測極限可達pM。再者,利用TBAs (TBA15TBA29)分別結合於thrombin的作用端III,以二價 (bivalent) TBAsthrombin結合並利用fibrinogen修飾的Au NPs (Fib−Au NP)作呈色反應,目標DNA的偵測極限可達pM並可實際檢測TP53基因中的SNP。我們更將PDGFthrombinaptamer (AptPDGFAptthr29) 修飾於同一Au NPs,在PDGF存在下,藉AptPDGF/Aptthr29−Au NPthrombin之間的相互作用減少,並利用Fib−Au NP進行光學偵測PDGFLOD可達pM。近期研究成果,我們更提出一新穎性概念以功能化Au NPs (functional gold nanoparticles, FAuNPs)搭配上微孔薄膜之比色法 (colorimetric method)於目標蛋白質檢測,此感測器系統藉由修飾不同aptamer/抗體的Au NPs及薄膜,及可具專一性且選擇性偵測目標蛋白質,並成功應用於真實樣品血液中thrombin和人免疫球蛋白G (human immunoglobulin G, hIgG)的分析,LOD可達nM。除了利用Au NPs作為探測器之奈米材料,我們亦開發了具有縱向表面電漿吸收金/銀奈米棒 (gold/silver nanorods, Au/Ag NRs),將其表面簡單修飾球狀肌動蛋白 (globular actin, G-actin) 形成G-actin−Au/Ag NRs,當加入三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP)會誘導G-actin−Au/Ag NRs產生聚合反應形成聚集而有呈色差異,藉此可偵測ATPLOD可達 25 nM。我們更進一步開發三種功能性奈米粒子透過兩個步驟選擇性靈敏的偵測hIgG,三種奈米粒子分別為修飾G蛋白 (Protein G, PG)之三氧化二鐵 (Fe2O3)磁化功能性奈米粒子 (簡稱為FMNPs)PG aptamer修飾的功能性Au NPs (簡稱為FAuNPs)以及Fib−Au NPs。第一步利用PG−hIgG−PG特殊結合性形成FMNPs−hIgG−FAuNPs,再利用磁鐵將此複合物從溶液中分離,第二步利用溶液中游離之FMNPsaptamerthrombin專一性結合會抑制Fib−AuNPs的聚集情形,藉此二步驟可在血漿樣品中偵測hIgG達到nM等級。另外,以兩種具功能性核酸適合體 (AptpolAptRH)分別修飾於Au NPs上,調控核酸適合體的密度及其與Au NPs的距離 (Tm),開發出抑制第一型人類免疫缺陷病毒反轉錄酶 (human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase, HIV-1 RT)活性之金奈米複合材料。40Aptpol-T45-Au NPs40AptRH-T45-Au NPs分別與HIV-1 RT的聚合酶 (polymerase)及核糖核酸內切酶 (RNase H)結合,能穩定存在於細胞中。使用KOHCa(OH)2處理的魔芋葡甘聚醣膜 (konjac glucomannan, KGM)作為生物材料用於傷口癒合,且結果顯示Ca(OH)2處理的KGMKOH處理的KGM具有更好的抗張強度、伸長率和溶脹比能被用作敷料能有更好的促進傷口癒合能力。接著,我們將癌症生物標誌物黏蛋白一型 (mucin 1, MUC1)結合適合體(MUC1 binding aptamer, AptMUC1)修飾Au NPs(AptMUC1-Au NPs),再修飾於GO (AptMUC1-Au NPs/GO)上,結合熱休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)的抑制劑和近紅外光照射,可有效殺死MUC1表現的癌細胞。

1.         J.-W. Jian and C.-C. Huang*, Chem. Eur. J. 2011, 17, 2374–2380.

2.        C.-K. Chen, Y.-C. Shiang, C.-C. Huang and Chang, H.-T.*, Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3464–3468.

3.         Y.-Y. Chen, C.-W. Tseng, H.-Y. Chang, Y.-L. Hung and C.-C. Huang*, Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3160–3166.

4.         T.-E. Lin, W.-H. Chen, Y.-C. Shiang, C.-C. Huang* and H-T Chang*, Biosens. Bioelectron. 2011, 29, 204–209.

5.         Y.-C. Shiang, C.-M. Ou, S.-J. Chen, T.-Y. Ou, H.-J. Lin*, C.-C. Huang and H.-T. Chang*, Nanoscale 2013, 5, 2756−2764.

6.       J.-W. Jian, W.-C. Chiu, H.-T. Chang, P.-H. Hsu* and C.-C. Huang*, Anal. Chim. Acta 2013, 774, 67-72.

7.       Y.-J. Liao, Y.-C. Shiang, L.-Y. Chen, C.-L. Hsu, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Nanotechnology 2013, 24, 444003.

8.       T.-E. Lin, C.-L. Li, Y.-C. Shiang C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, J. Spectrosc. Dyn. 2014, 4, 9.

9.         Y.-Y. Chen, B. Unnikrishan, Y.-J. Li and C.-C. Huang*, Analyst 2014, 139, 5977–5982.

10.     Y.-C. Huang*, H.-W. Chu, C.-C. Huang, W.-C. Wu and J.-S. Tsai, Carbohyd. Polym. 2015, 117, 778–787.

11.     L. Yang, Y.-T. Tseng, G. Suo, L. Chen, J. Yu, W.-J. Chiu, C.-C. Huang* and C.-H. Lin*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 5097–5106.

在生物分子偵測器的開發方面,從一開始的修飾染料到後來的免標示的感測器開發,都受到溶液鹽類的極大影響,而實際在偵測真實樣品時,除了鹽類之外,樣品中基質亦造成檢測上的干擾。上述問題,我們皆可藉由改變奈米粒子表面性質或控制表面保護劑獲得改善,甚至搭配薄膜以克服和突破檢測生物分子之干擾因子。此外,以往的研究成果大都於生物體外的條件下完成,而我們目標以朝著生物體內的方向 (:細胞培養與活鼠試驗等)進行,使開發之分析系統達更快速、簡便及多樣性分析。

 

三、微奈米粒子合成與應用

利用不同鏈長硫醇 (thiol)分子修飾之金奈米量子點 (gold nanodots, Au NDs),可合成出不同放光波長 (501-618 nm)Au NDs,藉由調控其表面電性及thiol密度,即可得到較高量子產率或更快速合成之奈米量子點。利用甘露糖 (mannose)修飾的Au NDs (Man-Au NDs)可用於大腸桿菌 (Escherichia coli, E. coli)偵測,同時利用Man−Au NDs會使細菌聚集的特性,可有效的抑制細菌生長。另外於合成Man−Au NDs時,額外添加硼氫化鈉 (NaBH4),可合出量子產率更高 (>20%)Man−Au NDs11-巰基十一烷酸 (11-mercaptoundecanoic acid, 11-MUA)修飾到Au NDs (11-MUA−Au NDs)上,利用其電子轉移誘導11-MUA−Au NDs螢光下降,可檢測血液樣品中的高鐵血紅素 (hemin)及血紅蛋白 (hemoglobin)0.5 nM。另一方面,將蛋白質A (protein A)修飾於11-MUA−Au NDs成螢光Au NDs (PA−Au NDs)可以專一性偵測人類抗體 (hIgG),此方法LOD可達10 nM。而搭配上脂質體 (liposome)合成11-巰基十一烷酸金奈米點/脂質體 (11-mercaptoundecanoic acid−gold nanodot−liposome, 11-MUA−Au ND/Lip)複合物,則具備高靈敏性 (LOD0.21 nM)和高選擇性以檢測細胞中磷脂酶C  (phospholipase C, PLC)。利用mannose與檸檬酸銨 (ammonium citrate)之粉末混合鍛燒合成mannose之碳螢光量子點 (mannose-modified fluorescent carbon quantum dots, Man-CQDs),其量子產率為9.8%。大腸桿菌 (wild-type1 E. coli K12 strain)纖毛上的受器 (FimH lectin unit)結合Man-CQDs修飾之mannose,藉由離心將沒結合的Man-CQDs洗掉,以藉由結合上E. coliMan-CQDs螢光推算E. coli之濃度,最低可偵測450 CFU/mL。利用1-十二硫醇 (1-dodecanethiol, DT)和抗菌胜肽枯草素 (surfactin, SFT)修飾的金奈米量子點 (SFT/DT–Au NDs) 可用於殺菌 (如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus (S. aureus)))上面,是治療傷口和皮膚感染臨床應用有前途的抗菌候選人。近期,我們合成11-mercaptoundecyl -N,N,N-trimethylammonium包覆的Au NDs (11-MUTAB-Au NDs),藉由調控超聲波震盪11-MUTAB-Au NDs的時間,可以合成出不同放光 (540-810 nm)和量子產率 (0.01-11.5%)11-MUTAB-Au NDs

利用純化後的11-MUA−Au NDs (p11-MUA–Au NDs)再外加11-MUA形成Au NDs@11-MUA,可以於生物樣品中檢測Hg2+及有機汞離子。利用(N−異丙基丙烯醯胺) (Poly(N-isopropylacrylamide))微凝膠所製備成的金奈米點(N−異丙基丙烯醯胺)微凝膠 (Au ND−PNIPAM MG),當加入Hg2+後,會形成金汞合金且進而導致Au ND−PNIPAM MG的螢光下降,此探針對偵測Hg2+有良好之靈敏度 (LOD1.9 nM)及選擇性。另外,兩性分子可鑲嵌於在螢光Au NDs上的長碳鏈thiol分子,便可調控Au NDs的放光波長,並用於亞硝酸根離子 (NO2)檢測可達40 nM。牛血清白蛋白-金奈米團簇 (BSA−Au25 nanoclusters)會受NO2的影響而導致螢光淬滅,藉此可以在實際環境樣品 (湖水與河水等)中檢測NO2100 nM再者,利用薑鍛燒成的螢光碳奈米點 (carbon nanodots, C-dots)可用於腫瘤細胞標定,並能夠抑制小鼠身上肝癌腫瘤細胞生長。另外,利用簡單水熱法將L-半胱氨酸 (L-cysteine)製備成C-dots,其激發光為325 nm395 nm處有光致發光,量子產率為13.2%。其表面的L-cysteine與鈷離子 (Co2+)形成無光致發光的CoxSy致使C-dots聚集而使螢光下降。藉由螢光淬滅程度定量Co2+濃度,並可應用於湖水、飲用水及維他命B12之檢測。最後,以二氧化矽 (SiO2)作為外殼,接上聚乙二醇(poly(ethyleneglycol))和胺基團 (amine groups)合成CuInS2/ZnS之螢光量子點和磁性奈米簇,可有效應用於標定細胞內囊泡和核磁共振顯影。隨後,我們成功地製造順磁性的且有標誌性的葉酸 (folate)–釓石墨烯量子點 (folate–gadolinium graphene quantum dots, folate–GdGQDs)同時具有專一性標誌癌細胞且能用於核磁共振成像 (magnetic resonance imaging, MRI)顯影,且可再搭載抗癌藥物阿黴素 (Doxorubicin)做專一性毒殺癌細胞。另外,我們對使用植物葉衍生化合成石墨烯量子點(GQDs)後再利用膜聯蛋白V抗體 (annexin V antibody, AbA5)修飾後形成AbA5-GQDs,可以使用於體內標記凋亡細胞的目的 (顯影),且具有低的細胞毒性。其後我們用苯酸 (phenylboronic acid)修飾的螢光C-dots共軛修飾到能分散於水相的氧化錳鐵磁性奈米粒子 (MnFe2O4),使奈米粒子同時具有磁性和螢光,可用於MRI顯影和不溶於水的化療藥物載體 (Doxorubicin)於癌症診斷和化學治療上。其後利用ammonium citrate乾燒出具有螢光的CQD後,再用甘露糖(mannose, Man)或葉酸(folic acid, FA)進行第二次乾燒成Man-CQDFA-CQD,可分別辨識E. coli和癌細胞,且可用於偵測。

1.     Y.-C. Shiang, C.-A. Lin, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Analyst 2011, 136, 1177–1182.

2.     Y.-T. Tseng, H.-T. Chang, C.-T. Chen, C.-H. Chen and C.-C. Huang*, Biosens. Bioelectron. 2011, 27, 95100.

3.     J.-C. Hsu, C.-C. Huang, K.-L. Ou, N. Lu, F.-D. Mai, J.-K. Chen and J.-Y. Chang*, J. Mater. Chem. 2011, 21, 19257–19266.

4.     Y.-C. Shiang, C.-C. Huang, W.-Y. Chen, P.-C. Chen and H.-T. Chang*, J. Mater. Chem. 2012, 22, 12972–12982.

5.     K.-L. Ou, J.-C. Fan, J.-K. Chen, C.-C. Huang, L.-Y. Chen, J.-H. Ho and J.-Y. Chang*, J. Mater. Chem. 2012, 22, 14667–14673.

6.     L.-Y. Chen, C.-C. Huang, W.-Y. Chen, H.-J. Lin and H.-T. Chang*, Biosens. Bioelectron. 2013, 43, 38−44.

7.     H.-Y. Chang, H.-T. Chang, Y.-L. Hung, T.-M. Hsiung, Y.-W. Lin* and C.-C. Huang*, RSC Adv. 2013, 3, 4588−4597.

8.     L.-Y. Chen, C.-M. Ou, W.-Y. Chen, C.-C. Huang, H.-T. Chang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2013, 5, 4383−4388.

9.     W.-Y. Chen, L.-Y. Chen, C.-M. Ou, C.-C. Huang*, S.-C. Wei and Huan-Tsung Chang*, Anal. Chem. 2013, 85, 8834−8840.

10. B. Unnikrishnan, S.-C. Wei, W.-J. Chiu, J. S. Cang, P.-H. Hsu and C.-C. Huang*, Analyst 2014, 139, 22212228.

11. C.-L. Li, C.-M. Ou, C.-C. Huang, W.-C. Wu, Y.-P. Chen, T.-E. Lin, L.-C. Ho, C.-W. Wang, C.-C. Shih, H.-C. Zhou, Y.-C. Lee, W.-F. Tzeng, T.-J. Chiou, S.-T. Chu, J. Cang and H.-T. Chang*, J. Mater. Chem. B 2014, 2, 4564–4571.

12. M.-K. Dai, T.-Y. Lin, M.-H. Yang, C.-K. Lee, C.-C. Huang and Y.-F. Chen*, J. Mater. Chem. C 2014, 2, 5342–5349.

13. Y.-T. Tseng, Z. Yuan, Y.-Y. Yang, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, RSC Adv. 2014, 4, 3362933635.

14. W.-Y. Chen, C.-C. Huang* L.-Y. Chen and H.-T. Chang*, Nanoscale 2014, 6, 11078–11083.

15.   C.-L. Li, C.-C. Huang, A. P. Periasamy, P. Roy, W.-C. Wu, C.-L. Hsu and H.-T. Chang*, RSC Adv. 2015, 5, 2285–2291.

16.   C.-I. Weng, H.-T. Chang, C.-H. Lin, Y.-W. Shen, B. Unnikrishnan, Y.-J. Li, and C.-C. Huang*, Biosens. Bioelectron. 2015, 68, 1–6.

17.   C.-L. Huang, C.-C. Huang, F.-D. Mai, C.-L. Yen, S.-H. Tzing, H.-T. Hsieh, Y.-C. Ling and J.-Y. Chang*, J. Mater. Chem. B 2015, 3, 651−664.

18.   P. Roy, A. P. Periasamy, C.-Y. Lin, G.-M. Her, W.-J. Chiu, C.-L. Li, C.-L. Hsu, C.-C. Huang*, C.-T. Liang and H.-T. Chang*, Nanoscale 2015, 7, 2504–2510.

19.   M. Z. Fahmi, J.-K. Chen, C.-C. Huang, Y.-C. Ling and J.-Y. Chang*, J. Mater. Chem. B 2015, 3, 5532–5543.

20.   W.-Y. Chen, H.-Y. Chang, J.-K. Lu, Y.-C. Huang, S. G. Harroun, Y.-T. Tseng, Y.-J. Li, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Adv. Funct. Mater. 2015, 25, 7189–7199.

21.   I. P.-J. Lai, S. G. Harroun, S.-Y. Chen*, B. Unnikrishnan, Y.-J. Li and C.-C. Huang*, Sens. Actuators, B Chem. 2016, 228, 465–470.

22.   Y.-T. Tseng, R. Cherng, Z. Yuan, C.-W. Wu, H.-T. Chang* and C.-C. Huang*, Nanoscale 2016, 8, 5162–5169.

Au NDs的研究中其發光原理及其調控,是當前的研究重點,藉由各種條件的探討及鑑定,期望可以對於其機制的探討有所幫助。再者,螢光C-dots是目前相當熱門的奈米材料,因此開發出簡易合成、穩定性佳、低毒性、量子產率高及應用性廣的螢光碳材 (應用在細胞標定或是用於各種生物樣品檢測),將會是我們下一個努力目標。

 

四、 抗凝血奈米藥物

Thrombin為凝血機制中主要的酵素,我們根據DNA互補特性將TBA設計一段結合序列 (hybrid TBA, hTBA)與修飾在Au NPs上序列之 (cDNAAu NPs)互補,發現hTBA可因其互補特性在Au NPs移動至最適合與thrombin結合的距離,經由TBA15TBA29兩者的結合力增加對thrombin活性的抑制。另外,除了修飾兩種TBA (TBA15TBA29),再修飾上另一抗凝血分子硫酸半乳糖酸 (sulfated galactose acid, sulf-Gal),經由多重結合 (multivalent binding)效應來增強與thrombin的結合力。此外,我們改變兩種TBA本身序列如Au NPs連結序列長度 (linker length number)與髮夾對結構 (hairpin pair number)發現能影響其穩定性及抑制thrombin效果。並且在TBA序列中設計光分解官能基 (photocleavable unit),可藉由照射紫外光回復凝血作用。而後,利用分子印記 (molecularly imprinted, MP),以thrombin當做模版 (template)固定兩種TBAthrombin結合位置並修飾於Au NPs後將template thrombin移除,發現此方法合成之MP-TBA−Au NPs相較於TBA−Au NPs其抑制能力高出8倍。

此外,我們將TBA29–Au NPs修飾於氧化石墨烯 (graphene oxide, GO)形成TBA29–Au NPs/GO抑制劑,並以協同抑制 (synergistically inhibit)作用,降低thrombin活化fibrinogen形成網狀結構血纖維蛋白 (fibrin)的活性。為了提高抑制劑在血漿樣品中抑制凝血作用,我們在原本的抑制劑中引入抗凝血藥物-肝素 (heparin),使其與我們材料結合製備成TBA29–Au NPs/heparin/GO抑制劑,並偵測其延長thrombin凝固時間(thrombin clotting time, TCT)。相較之下,TBA29–Au NPs/heparin/GOTCTTBA29–Au NPs21.4倍、TBA29–Au NPs/GO17.0倍及其他市售抗凝血藥物 (: 肝素、阿加曲班 (argatroban)、水蛭素 (hirudin)、華法林 (warfarin))100倍以上。在TBA29–Au NPs/heparin/GO中,TBA29–Au NPsthrombin高選擇性使得heparin更易與thrombin結合,又因TBA29–Au NPs本身的立體障礙,降低fibrinogen活性位置與thrombin結合而達到抑制效果,且其具備低毒性及低溶血作用,顯示此複合材料具潛力開發為安全之高效型抑制劑。另外,自組裝混合單層 (self-assembled hybrid monolayer, SAHM)TBA15h20A20 (TBA15尾端有20個單元可和後一條雜交互補和有20個腺嘌呤 (adenine)可和Au NPs表面作用)/TBA29h20A20 (TBA29尾端有20個單元可和前一條雜交互補和有20adenine可和Au NPs表面作用)-Au NPs具有良好的抗凝血性 (比商業抗凝藥物TCT10),且相較於之前尾端為巰基 (-SH)TBA的便宜很多。

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在這一系列的研究中,最大的問題是不論利用解毒劑或是光分解官能基來回復凝血,在生物體外都需要一段時間且無法完全回復原本的凝血效果。即便目前已有安全且高效型抑制劑,其GO的大小仍為我們改進的目標之一。近期成功使用末端為poly adenineTBAs修飾到Au NPs後仍具有良好的抗凝血性,大幅降低成本 (和之前尾端為巰基 (-SH)TBA)。此外,若能將此高效型抑制劑發展成快速回復原本凝血效果的抗凝血奈米藥物,也是我們所希望的研究方向。

 

五、奈米粒子於質譜應用

在雷射脫附游離質譜 (laser desorption/ionization mass spectrometry, LDI-MS)研究中發現,奈米粒子經由脈衝雷射擊打後能進行脫附游離,並可於質譜儀中觀察到奈米團蔟 (nanoclusters)離子的訊號,此技術可應用於定性和定量奈米粒子表面合金的組成,也可進一步鑑定其表面鍵結分子,並應用於奈米薄膜感測器之開發。利用表面修飾BSAAu NPsNCM薄膜搭配LDI-MS,可有效偵測並定量生物樣品 (尿液及血液)中的Pb2+含量 (LOD 可達nanomolar)。將Au NPs修飾於MCEM並結合LDI-MS,可於真實樣品中 (尿液、食鹽產品)定量I (LODnanomolar)。此外,本技術亦可應用於蛋白質的檢測上,利用Apt−Au NPs/NCM並與thrombin反應後,觀察經雷射擊打後所游離出之Au 團簇 (clusters)離子訊號變化,用於定量血清中thrombin濃度。進一步,利用Fib−Au NPs結合MCEM,結合LDI-MS,可定量血纖維蛋白溶酶 (plasmin)和血纖維蛋白溶解酶原 (plasminogen)之濃度達0.1 nM。故利用Fib−Au NPs/MCEM作為LDI-MS的基質,不僅可以增強Au NP表面的訊號,亦可將誤差降低至5 ppm以內。此外,我們亦可藉由此系統以監控凝血產生 (thrombin generation),應用於診斷防凝血與超凝血等各種健康問題,LOD可達2.5 pM,相對於其他蛋白質其選擇性達1000倍以上差異。另一方面,我們利用表面修飾抗體 (antibody, Ab)Au NPs (Ab–Au NPs)搭配NCM,可有效偵測環境水樣中細菌含量。而後,藉由Au NPs上修飾不同長度及密度的帶有巰基官能基DNA (SH-DNA)觀察Au clusters之訊號改變,提供第一個藉由LDI-MS分析修飾在Au NPs材料上的DNA結構與覆蓋率。另外,我們用汞碲奈米結構 (HgTe nanostructure-based matrices, HgTe NMs)取代LDI-MS分析中傳統的有機基質,可有效分析到42,000 Da的訊號,且可分析到生物素-聚乙二醇修飾的Au NPs (biotin-polyethylene glycol-Au NPs)和抗生物素蛋白 (avidin)結合後的訊號,此系統在生物辨識中具有巨大的潛力。近期,我們利用合成出的汞碲奈米結構基質 (HgTe nanostructure-based matrices, HgTe NMs)、汞硒奈米結構基質 (HgSe nanostructure-based matrices, HgSe NMs)和汞碲硒奈米結構基質 (HgTeSe nanostructure-based matrices, HgTeSe NMs)結合LDI-MS,可分析不同的藻類。

在核酸分析部分,首創酵素放大訊號傳遞的探針系統利用免標示 (label-free method)搭配LDI-MS技術之進行SNP和微型核糖核酸 (microRNA, miRNA)的檢測分析,將R6G修飾在GO後形成R6G−GO基質。當加入單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA)後,以LDI-MS偵測其R6G的訊號會上升,故可進行ssDNA之分析,我們進一步結合探針DNA (probe DNA)和外切酶III (exonuclease III, Exo III)。當目標miRNA加入時,probe DNAmiRNA互補反應,再經由Exo III消化 (digest)作用後,最終以LDI-MS分析時藉由偵測到的R6G訊號上升,可間接偵測樣品中miRNA濃度,LOD可達fM等級。我們亦利用Au NPs/MCEM系統搭配上LDI-MS,開發出亞砷酸根離子 (AsO2)之檢測方法,並利用質譜分析,以[Pb]+/[Au]+訊號比值定量AsO2濃度,LOD可達2.5 nM,此LOD遠低於美國環境衛生署 (US EPA)對於飲用水的標準,同時此系統也被證明可以在真實水樣品中 (自來水、地表水和礦泉水等)偵測AsO2。另外,我們亦可利用未修飾之薄膜應用於Pb2+檢測,可成功於真實水樣 (如自來水、地表水和礦泉水等)及吸管等樣品中檢測Pb2+濃度,LOD可達pM

以癌細胞偵測方面,以AptMUC1修飾Au NPs (AptMUC1-Au NPs),再修飾於GO (AptMUC1-Au NPs/GO) 藉由LDI-MS所得到的質譜圖上[Au]+訊號來推算癌症細胞位置顯影,最低可偵測100顆乳癌細胞 (MCF-7),並可分析四種不同MUC1 表現之細胞。另以AptMUC1修飾於金奈米薄膜 (gold nanofilms, Au NFs)AptMUC1-Au NFs,藉由循環癌細胞結合AptMUC1-Au NFs抑制[Au]+訊號,由質譜圖上[Au]+訊號來推算MCF-7之數量,最低可偵測10顆細胞。

1.        Y.-C. Liu, C.-K. Chiang, H.-T. Chang, Y.-F. Lee and C.-C. Huang*, Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 44484455.

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根據現階段之研究發現,利用修飾官能基的Au NPs製成之奈米薄膜擁有較穩定的均勻度,而奈米粒子表面不修飾直接製成之試紙薄膜後亦具有選擇性偵測陰離子、癌細胞等等。而合成的HgTe NMs可分析大範圍之m/z (同時分析樣品包含小分子及高分子片段),且HgSe NMs HgTe NMsHgTeSe NMs已可用於分析不同種的藻類。在LDI-MS結合的複合性奈米材料合成時須注意其再現性及脫附游離之效率,如何解決這些問題將是影響後續研究的門檻。

 

六、仿生物催化奈米酵素

利用Au NPsPb2+Hg2+在不同pH值所誘導出的過氧化物酶 (peroxidase)活性程度上的不同,以催化過氧化氫 (H2O2)Amplex® UltraRed (AUR)反應,生成具有螢光之AUR product,當peroxidase活性越高則螢光強度越高,故可分用以偵測Pb2+Hg2+濃度。利用寡核苷酸 (Oligonucleotide, T30695)修飾Au NPs (T30695–Au NPs)後,藉由Pb2+形成金鉛合金和Oligonucleotide–Pb2+的複合物使peroxidase活性增高,使偵測Pb2+LOD50 pM,亦可利用於偵測血液中Pb2+。此外,利用鉍離子 (Bi3+)Au NPs進行親金作用 (aurophilic interaction)後,產生很強的peroxidase活性 (催化H2O2和沒有螢光的Amplex® Red (AR)反應,生成具有螢光的試鹵靈 (resorufin)),可用於偵測H2O2含量。另外fibrinogenthrombin催化會形成網狀結構的fibrin,因此將Fib修飾在Bi–Au NPs表面 (Fib-Bi–Au NPs)thrombin會誘導Au NPs表面形成fibrin,導致Bi–Au NPsperoxidase活性降低,故可用以偵測thrombin並可應用於抗凝血藥的篩選。最近,我們成功以一鍋 (one-pot)合成鉑/金奈米粒子 (platinum/gold nanoparticles, Pt/Au NPs),其具有相當高的peroxidase活性。加入Hg2+後,Pt/Au NPsperoxidase活性明顯下降,經由電子順磁共振 (electron paramagnetic resonance, EPR)證明加入Hg2+後,Pt/Au NPsperoxidase活性轉移成過氧化氫酶 (catalase)活性,使催化形成的resorufin量減少致使螢光強度下降,藉此來檢測Hg2+。此外,利用加入不同的金屬離子 (Ag+Bi3+Pb2+Pt4+Hg2+)使其沉積於Au NPs後,以調控Au NPs使其具有不同的酵素活性 (過氧化物酶 (peroxidase, POX)、氧化物酶 (oxidase, OX)和過氧化氫酶 (catalase, CAT)),並進一步以金屬離子 (Hg2+/Bi3+Pt4+/Hg2+Pb2+/Hg2+Ag+/Bi3+)當作輸入,Au NPs的酵素活性當做輸出,構建出ORANDINHIBITXOR邏輯閘 (logic gate)。而後,藉由另外建構出的邏輯閘Pt4+/Pb2+(AND)−Au NPPOXBi3+/Hg2+(INHIBIT)−Au NPPOX可分別選擇性偵測水樣中的Pb2+Hg2+,且可用構建出邏輯電路以產生氧氣氣泡 (Hg2+)和紅色resorufin (Pb2+)的方式用視覺分別辨識水樣中含有Hg2+Pb2+。另外,修飾上Ag NPsAu NPs的陽極氧化鈦 (anodic titanium oxide, ATO)具有更佳的吸光度,且提供好的催化光解效率可用於殺菌使用,相較於沒有照紫外光的對照組 (106 CFU/mL),照紫外光的E. coli存活率變成102 CFU/mL。接著,利用Te NTsAg+Au3+進行galvanic replacement reaction合成Au/Ag−Te NSs (NSs: nanostructures),具有相當高的oxidase催化活性,能轉變沒有螢光的AR,形成有螢光產物resorufin,揭示能產生活性氧物質 (reactive oxygen species, ROS),能用於殺菌 (大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌),並結合魔芋果凍膜 (konjac jelly film)後測得的抑菌圈,顯示在如傷口敷料減少細菌傷口感染有巨大的潛力。近期,我們準備了非晶相氫氧化/氧化鐵固定在還原型氧化石墨烯 (iron hydroxide/oxide immobilized on reduced graphene oxide, FeOxH–rGO)上的奈米複合材料,具有高的peroxidase活性,而加入硫離子 (S2−)後會形成FeSFeOxH–rGO奈米複合材料表面上,而使peroxidase活性下降,藉此可用於水樣中的S2−偵測。另外我們利用合成具有peroxidase活性和對血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)aptamer修飾Au NPs固定在鉍氧化氯奈米複合材料 (Apt–AuNPs immobilized on bismuth oxychloride nanosheets, Apt–AuNPs/BiOCl),在加入VEGFApt–AuNPs/BiOClperoxidase活性下降,藉此可用於VEGF偵測。其後成功開發一步合成aptamer包覆銅奈米粒子 (TBA29-Tn–CuO/Cu2O),具有peroxidase活性,並發現TBA29-Tn–CuO/Cu2Othrombin結合後催化活性會下降,利用此特性應用於檢測thrombin,在血清的環境下進行蛋白選擇性偵測實驗,偵測極限為0.5 nM,並成功應用於不同aptamer,合成AptMUC1-T30–CuO/Cu2O NPs可以用於檢測MUC1蛋白大量表現的細胞。

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在我們過去研究中知道可利用one-pot直接合成出有peroxidase活性的Pt/Au NPs或者藉由Au NPs加入Ag+Bi3+Pb2+Pt4+Hg2+後會誘導出不同的酵素活性 (peroxidase, oxidasecatalase),且利用galvanic replacement reaction合成的Au/Ag−Te NSs具有高的催化活性可用於抑菌,FeOxH–rGO可用於偵測水樣中的S2−,最後合成的Apt–AuNPs/BiOClTBA29-Tn–CuO/Cu2OAptMUC1-T30–CuO/Cu2O NPs可分別偵測VEGFthrombinMUC1表現的癌細胞,但這些材料皆會受到生物環境干擾 (如蛋白質等)下降其活性,未來希望能合成在生物環境下仍具有高的酵素活性的奈米複合材料,並結合辨識性的分子可更有效用於不同癌細胞的偵測。